Fråga:
Hur bryter du upp cellklumpar när du passerar?
Rob O'Callahan
2011-12-22 07:55:37 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Jag arbetar med HepG2-celler och de gillar verkligen att bilda klumpar. Pipettering upp och ner i TrypLE verkar inte vara särskilt effektivt för att bryta upp dem.

Rob: kan den här frågan besvaras av Google? Om det kan, kom tillbaka och lägg upp ett svar på din fråga. Här är en ledtråd: http://hepg2.com/index.html
Tre svar:
#1
+5
Jeremy
2012-01-17 09:40:10 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Jag tycker att jag bara får klumpar (med HeLa och liknande celltyper) om jag lämnar dem i Tryple för länge. I allmänhet lämnar jag dem i rumstemperatur (inte hett) Tryple i ~ 8 minuter, sedan vinklar jag skålen, locket av, så att jag kan se "glansen" av celler på skålen (detta händer naturligtvis ). Sedan spränger jag glansen med Tryple med en pipett på 1000ul, som avhäftar cellerna. Dessa är i allmänhet mycket mindre klumpiga än om jag låter Tryple avhäfta cellerna.

#2
+3
kasia
2012-01-15 19:52:12 UTC
view on stackexchange narkive permalink

I vissa protokoll för att ställa in primärkulturer (till exempel från musbenmärg eller endometrium från råtta) finns det ett steg som kräver att man pressar cellsuspension genom en stor nål för att bli av med klumpar. Naturligtvis medför detta en hög risk för att skada cellerna, så ibland används kollagenas istället.

Det kan också vara till hjälp att tvätta dina celler med PBS utan joner innan du passerar och använda tripsin med EDTA. Det borde bli av med åtminstone lite kalcium från plattan, så att vidhäftningsproteinens verkan skulle hämmas.

#3
+3
Valentinos
2012-02-17 21:28:23 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Cellklumpar som inte dissocierar med rigorös pipettering kan mycket väl orsakas av fritt DNA i din cellsuspension (dvs. om du trypsiniserade för länge). Gratis DNA lockar celler som helt binder och bildar klumpar.

Två möjliga sätt att bli av med dessa klumpar:

  1. Centrifugera din cellsuspension vid 5000 rpm i 2 minuter med acceleration på (vid 4) och bromsar (vid 3) så att tyngre molekyler kan fällas ut. Sug sedan upp ~ 0,5 ml från toppen av suspensionen och överför till en ny kolv. Upprepa om det behövs.
  2. Använd DNAse vid koncentrationer från 20-100 µg / ml (koncentration till följd av personlig användning) så länge du inte tänker utföra DNA-relaterade experiment.

Du kan alltid gå tillbaka och köpa en ny ampull av den cellinje du vill ha klumpar gratis :)



Denna fråga och svar översattes automatiskt från det engelska språket.Det ursprungliga innehållet finns tillgängligt på stackexchange, vilket vi tackar för cc by-sa 3.0-licensen som det distribueras under.
Loading...