Fråga:
Hur skulle man gå till med att identifiera okända cellcykelkontrollproteiner (dvs. cykliner)?
michaelrw
2016-12-12 09:40:57 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Nej det här är inte "läxor". Jag är doktorand, och det här var något som togs upp i slutet av en journalklubb nyligen, och en av PI: erna ställde den här frågan och ber oss att tänka på det. Det låter enkelt, men det har liksom gjort mig förvirrad.

  • Western blot: Nej. Behöver ett känt antigen och så, eftersom vi inte vet vad vi letar efter kommer inte detta att fungera.

  • Total proteingel: Samla celllysat från olika cellpopulationer som finns i olika delar av cellcykeln, kör den på en gel och observera eventuellt cykliskt uttryck. Det här verkar som om det är ok men jag känner att det finns några problem med det: 1) att identifiera de cellpopulationer som befinner sig i olika cykelsteg; 2) andra proteiner av samma / liknande storlek som inte kan differentieras.

  • Någon typ av RNAi, knockdown, etc.: Som Western blot, vi vet inte vad vi har att göra med och kan därför inte rikta oss mot någonting.

  • Pulldown-analys med massspecifikation: Jag vet inte vet mycket om det förutom att det ser på protein-protein-interaktioner. Osäker på om det skulle vara lämpligt här.

När det gäller en modell tänkte jag antingen jäst eller någon odödlig däggdjurscellinje.

Man kan ganska enkelt göra genomgående knockdown-experiment idag, så rabattera inte RNAi / siRNA direkt. Vilka verktyg du väljer kommer att bero på vilken modell du använder. Om det är jäst har du många validerade verktyg till ditt förfogande, inklusive mutanter / knockouts för varje enskild gen i * S. cerevisiae * genom, tvåhybridsystem för att titta på protein-protein-interaktioner, reporterkonstruktioner som indikerar genom fluorescens eller enzymatisk aktivitet när genen av intresse uttrycks och andra.
För jäst brukade människor förlita sig på mutanter / knockouts som förmodligen är lätta att producera med HR jämfört med andra organismer. För djurceller använder människor i stor utsträckning RNAi / CRISPR-Cas-skärmar med hög genomströmning för att identifiera funktionerna hos en gen. Om du har proteinsekvensen kan du uttrycka den och ta upp antikroppar mot den. Med antikropparna kan du Co-IP-MS för att identifiera protein-protein-interaktioner och ChIP-Seq (för TF) eller CLIP-RNAseq (för RBP) för att identifiera protein-DNA respektive protein-RNA-interaktion. Sammantaget är din fråga ganska bred. Du borde begränsa det.
Ett svar:
mimat
2017-08-22 16:29:00 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Jag har faktiskt varit involverad i en jakt på kontrollpunktproteiner i kiselalger (en typ av eukaryota alger), cyklinfamiljen har utvidgats kraftigt i dessa organismer och vi försökte räkna ut vad dessa extra cykliner kände / signalerade [1].

I ett nötskal tittade den första författaren på olika tillstånd som sannolikt skulle påverka cyklinuttryck. De flesta av dessa tillstånd förhindrade celldelning (t.ex. brist på näringsämnen, G2 / M kemiska hämmare eller ljus) och prover togs före och efter att blockeringsförhållandena togs bort. Därefter kvantifierades mRNA av misstänkta cellcykelgener. Eftersom kontrollpunktsgenernas mRNA och proteincykler är extremt övergående tog det något att göra. Cykliner som reagerade på förhållandena karakteriserades med komplementeringsanalyser och andra tekniker.

Därefter användes jäst två hybridanalyser för att identifiera interagerande proteiner för att bygga upp nätverket [2]. I allmänhet var dessa experiment inte så enkla och att röra med väsentliga gener orsakar mycket problem men det är fortfarande ingenting jämfört med det ursprungliga jästcyklinarbetet där de slog igenom berg av temperaturkänsliga mutanter som är defekta i sin cellcykel (se arbetet med Lee Hartwell och Paul Nurse som fick Nobelpriset för detta 2001 med Tim Hunt.



Denna fråga och svar översattes automatiskt från det engelska språket.Det ursprungliga innehållet finns tillgängligt på stackexchange, vilket vi tackar för cc by-sa 3.0-licensen som det distribueras under.
Loading...